آنزیمهای سلولاز بخش نخست

آنزیمهای سلولاز بخش نخست

 سلولاز ها آنزیمهای هیدرولیز کننده پلی D-β(1-4) گلوکز هستند.

 سلولازها کاتالیست های پروتئینی کلوئیدی با وزن مولکولی بالا هستند که دستخوش تغيیر شده و از موادی چون Tricoderma Viride , Fusarium Solani , Tricoderma , Aspergillus Niger ,  و … به دست می آیند.

پیوندهای β 6-1  بین واحدهای تکرار شونده مجاور در زنجیر پلیمری سلولز مکان هایی هستند که نسبت به هیدرولیز کاتالیزوری به وسیله سلولاز آسیب پذیرند .

 سلولز با یک آنزیم تنها هیدرولیز نمی شود اما به کمک مجموعه فعالیتهای آنزیمی که با نظم خاص عمل می کنند هیدرولیز می شود تجزیه سلولز در طبیعت به آهستگی انجام می پذیرد زیرا معدودي از میکروارگانسیم ها سلولاز تولید می کنند که قادر به تجزیه و کامل سلولز و تولید گلوکز است. ساختار بلورين سلولز حمله  آنزیمی را مشکل می کند ولي قسمت بی شکل خیلی سریع تجزیه می شود. در ضمن همراه بودن سلولز با همی سلولز ، لیگنین و گاهی پکتین باعث می شود که حمله آنزیمی سلولاز به سلولز کندتر شود .

پکتین به همي سلولز ، سلولز و نیز پروتئین ها متصل گردیده است به علاوه پکتین با یونهای فلزات قلیایی  خاکی و فلزات سنگین نظیر کلسیم یا آهن ترکیبات نامحلول در آب تشکیل می دهند. کمپلکس حاوی پکتین شبیه یک شبکه توری روی پنبه قرار گرفته و از پاک شدن چربی و واکس موجود در ساختمان پنبه جلوگیری می کند. شناخت ترکیبات مختلف پکتین برای انتخاب آنزیم مناسب و تبعاً بالا بردن راندمان عملکرد آنزیم قطعاً ضروری می باشد.

آنزیمهای سلولاز تهیه شده از منابع مختلف دارای خواص مولکولی متفاوت از جمله وزن مولکولی ، ترکیب آمینو اسیدها و ترتیب قرار گرفتن آنها ؛ نقطه ایزوالکتریک و محتوای کربوهیدارت اند .نسبت اجزای سلولاز ها به منبع و محیط کشت بستگی دارد.

ساختمان مولکولي آنزیمها مشابه پروتئین ها بوده و از نوع اول ، دوم ، سوم وچهارم می باشد و در مقابل درجه حرارت، تشعشعات یونی ، نور ، اسیدها ، قلیایی ها ، و فاکتورهای موثر بیولوژیکی بسیار حساس است وتخریب می گردد .

بر اساس مطالعات انجام گرفته انواع مختلفی از آنزیمها  در سیستمهای سلولازی وجود دارد که بر حسب نوع عملکرد تقسیم بندی می شوند و مهمترین آنها عبارتند از :

• اندوسلولاز ها EGS)(Endo β-1,4,Glucanase)) (C.3.2.1.4) که در هر محل شکستن تولید باقیمانده ای با گروه انتهایی و باقیمانده دیگری بدون گروه انتهایی می کنند .
• سلوبیوهیدرولازها Exo β-1,4Glucanase)) CBH)) C.3.2.1.91)) که واحدهای سلوبیوز را از انتهای زنجیر بصورت مرحله ای تولید می کند .
• بتاگلوکوزیدازها یا سلوبیازها C.3.2.1.2)) که هیدرولیز سلوبیوز به گلوکز را بعهده دارند ممکن است یک گونه قارچی مجموعه این فعالیت های آنزیمی را به دست دهد .

اندوسلولاز ها پیوندهای داخلی سلولاز را به طور تصادفی هیدرولیز می کنند و دو زنجیر کوتاهتر با سرهای آزاد می دهند که زمینه را برای عمل آنزیمهای سلوبیوهیدرولاز فراهم میکند . این آنزیمها ابتدا نواحی بی شکل  را هیدرولیز می‌کنند و سپس به قسمت نواحی بلوری با فعالیت کم هیدرولیتی پیش می روند. سیستمهای سلولازی کامل که باعث تخریب سلولز می شوند اندوسلولازهایی دارند که قویا روی سطح سلولز جذب می شوند و می توانند سلولز بلوری را نیز تخریب کنند .

 سلوبیوهیدرولازها اگزوگلوکانازهایی اند که واحدهای سلوبیوز را از انتهای غیر احیایی سلولز هیدرولیز کرده و یک واحد سلوبیوز را از یکي دو سر زنجیر سلولزی جدا می کنند .مطالعات انجام شده به وسیله میکروسکوپ الکتروني نشان می دهد که دونوع CBH(I,II) وجود دارند که یکی از آنها روی انتهای زنجیر عمل کرده در حالی که دیگری به سطح بلوری حمله می کند این آنزیمها روی سلودکسترینها وسلولز بلوری اثر می کنند اما بر سلوبیوز یا کربوکسی متیل سلولز ( CMC) بی اثرند . بتاگلوکوزیدازها زنجیرهای الیگوساکاریدی کوتاه که از سلولز مشتق شده اند و همین طور سلوبیوز را هیدرولیز می کنندکه در این صورت  موکوزیدازها زنجیرهای الیگوساکار بدن کوتاه ز بلوری اثر می کنند اما بر سلوبیوز یا کربوکسی متیل سلولز ( نجیر سلولزمونومرهای گلوکز تولید می شود و نمی توانند سلودکسترینهای با زنجیره بلند را هیدرولیز کنند. در حین عملیات آنزیمی مقدار سلوبیوز افزایش می یابد وباعث می شود که سلوبیوزها در فرآیند عمل آنزیمی به عنوان بازدارنده عمل کنند اما از طرفی بتاگلوکوزیدازها در این فرآیند از کند شدن فعالیت آنزیمی جلوگیری می کنند .

اولین مرحله  تخریب سلولز روی نواحی بی نظم صورت می گیرد و سرانجام به تخریب نواحی بلوری نیز منجر می گردد شکل 2-2 نحوه عمل آنزیم های سلولاز در تخریب سلولز را نشان می دهد .

رطوبت موجود ، اندازه و خصوصیات نفوذ پذیری مولکولهای سلولز و درجه تبلور آن ابعاد سلول واحد ، ساختار فضایی و ممانعت فضایی واحدهای گلوکز و درجه پلیمريزاسيون  از جمله عواملی هستند که برفعالیت سلولازها اثر می گذارند.

بنابراين فعاليت سلولازها روي سلولز نامحلول به عمليات قبلي كه روي آن انجام شده است بستگي زيادي دارد. چنين عملياتي شامل گرما دادن ، اكسيد شدن قليايي و تخريب مكانيكي است.

كاواكوپائولو در تحقيقاتي كه روي فعاليت هاي سلولوليتيكي سلولاز و اندوگلوكاناز خالص بررسي نمود دريافت كه فعاليت اگزو (Exo activity) سلولاز كامل ( سلولاز كامل شامل مخلوطي از سه آنزيم گفته شده است ) توسط حركات مكانيكي زياد،كاهش مي يابد بنابراين برتري جذب اندوگلوكاناز بر خلاف اگزوگلوكاناز در ميزان حركات مكانيكي زياد بيان شد . انتخاب PH  ، دما ،L:R ، نوع تجهيزات سطح حركتي و شرايط توزيع مواد مناسب ما را به نتايج مطلوب در فرآيند با آنزيم خواهدرساند.

سلولاز  ها معمولاً بر اساس محدوده PH حداكثر فعاليت خود طبقه بندي مي شوند در اين دسته بندي سلولازهايي كه در نساجي كاربرد دارند به سه دسته تقسيم بندي مي شوند :

• پايدار در محيط اسيدي
• پايدار در محيط خنثي
• پايدار در محيط قليايي

آنزيمهاي پايدار در محيط خنثي در 5/7-6 =PH بهترين فعاليت را دارند ودماي بهينه فعاليت آنها 50°C  است.

آنزيمهاي اسيدي در 5/5-5/4=PH و دماي 50°C بهترين فعاليت را نشان ميدهند اين دو نوع سلولاز در نساجي مفيدند و سلولازهاي مقاوم در محيط قليايي در شوينده هاي خانگي قابل استفاده اند تا به لكه گيري در شستشو كمك كرده ، پس از چند بار شستشو باعث نرمي وبهبود سطحي پوشاك مي شود .

اكثر آنزيمهاي سلولازي از يك پروتئين مركزي تشكيل شده اند كه موضع كاتاليزوري است در اين قسمت بخش انعطاف پذير غني از آمينو اسيدهاي سرين ، پرولين و تره ئونين وجود دارد كه قسمت پيوند ناميده مي شود و به موضع اتصال به سوبسترا متصل شده است .

موضع اتصال CBD  داراي يك گروه COOHيا –NH₂ است و قسمت اساسي آنزيم براي حمله به سلولز بلوري است .

براي شناخت مكانيسم حمله آنزيمي به سلولز و صنعتي كردن آن بررسي تأثير خصوصيات ساختار مواد بر سرعت هيدروليز آنزيمي لازم است خصوصياتي كه اثرشان بر هيدروليز مطالعه مي شود عبارتند از :

• درجه تبلور در آب
• بلورينگي
• آرايش مولكولي
• مقدار مواد همراه سلولز مانند ليگنين و همي سلولز
• ساختار لوله مويين الياف و سطوح قابل دسترس
• درجه پليمر شدن
• پيوندهاي گلوكوزيدي در دسترس

بحث درباره مكانيسم تجزيه سلولاز روي پنبه همچنان با ارائه نظريه هاي متفاوت ادامه دارد اما روشن است كه با حمله اندوسلولازها صورت مي گيرد و كمپلكس تشكيل مي‌شود. جذب تحت تأثير خواص شيميايي و فيزيكي سوبسترا ، تركيب اجزاي سلولاز و عوامل واكنش مانند دما و PH است .گفته مي شود كه جذب بهتر باعث فعاليت كاتاليزوري بيشتر مي شود بعد از شكستن يك واحد گلوكز ، مولكول آنزيم به موضع ديگر حمله مي كند يا از همان جا به تجزيه ادامه مي دهد .اينكه آنزيم به موضع ديگري مي رود يا نه ، وابسته به ماهيت سلولاز يا حتي ساختار ليف است مولكول سلولاز داران سه ناحيه است :

• بخشي كه به سرعت به مولكول سلولز مي چسبد .
• مركز يا هسته اي كه فعاليت كاتاليزوري دارد .
• اتصال دهنده (‌linker) كه پلي بين آنزيم وسلولز است .

بر اساس پژوهشهاي انجام شده گروهي از محققان شكل 3-2 را براي تجزيه آنزيمي سلولز پيشنهاد كرده اند .

مهمترين مطالعات انجام گرفته در زمينه استفاده از آنزيم سلولاز در نساجي شامل آهار‌گيري شستشو و سفيد گري ، سنگشويي و زيست پرداخت كالاي پنبه اي است. تأثير عمليات مرسريزه شدن در هيدروليز آنزيمي و اسيدي نيز بررسي شده است.

بعضي از عواملي كه سبب  توقف بازگشت ناپذير فعاليت آنزيمي مي شوند (سموم آنزيم )عبارتند از فرمالدئيد ،‌اسيدهاي تانيك مانند تانن هاي طبيعي ، مواد           After Treatmentبر مبناي ساختماني پلي فنوليك هاي ، پروتازها ، مواد سطح فعال ( انواع خاص آن ) و همچنين ميكروبيواسيدها.

اثر انزيم بر كاهش وزن و استحكام

همان طور كه قبلاً بيان شد ، آنزيم باعث تجزيه سلولز شده و آن را به واحدهاي قابل حل در آب ، تبديل مي كند، بنابراين بخشي از سلولز كاسته شده و از بين مي رود . در نتيجه مقداري از وزن كالا كاهش مي يابد. معمولاً فرآيند زيست پرداخت (Bio Polishing) به صورت مستقيم يا غير مستقيم از طريق كاهش وزني پارچه، كنترل مي شود و كاهش وزن پارچه نيز ناگزير باعث كاهش استحكام بعضي از پارچه‌ها مي شود معهذا اين كاهش استحكام را با كنترل زمان فرآيند مي توان كم كرد كاهش وزن 3-5% معمولاً باعث مي شود بدون اينكه استحكام پارچه بيش از اندازه كم شود اثرات زيست پرداخت  در پارچه ظاهر گردد .‍

 به طور كلي بررسي زمان فرآيند و غلظت آنزيم  مصرف شده بر اساس كاهش وزن و كاهش استحكام بررسي مي‌شوند. بنابراين براي بدست آوردن شرايطي كه هم از نظر زمان فرآيند و غلظت آنزيم مصرف شده و هم از نظر كاهش وزن و استحكام و هم از نظر نتيجه حاصل شده از فرآيند كاملاً مطلوب باشد بايد غلظت آنزيم و زمان عمليات با وزن و استحكام پارچه توأماً بررسي شود .‍

 اثر PH‌ در تكميل آنزيمي پنبه

 آنزيم سلولاز نيز مانند هر آنزيم ديگري تحت شرايط خاصي از PH ‌فعاليت مطلوب خواهد داشت . از آنجا كه تغييرات PH مستقيماً در راندمان عمليات اثر دارد ، كنترل و تنظيم آن در يك حد مطلوب ، اهميت زيادي دارد كه جهت ثابت نگه داشتن PH حمام ، در طول فرآيند بايد از يك سيستم بافر متشكل از اسيد استيك و استات سديم يا اسيد استيك و هيدروكسيد سديم استفاده كرد .

به طور كلي با استفاده از مقادير مختلف اسيد استيك و استات سديم ،‌PH هاي متفاوتي به دست مي آيد كه در جدول آمده است .

PH محلول بافر‌اسيد استيك و استات سديم با توجه‌به‌غلظتهاي‌مختلف هريك 

درصدحجمي‌اسيداستيك(‌مولار1/0)	درصد حجمي استات سديم (0/1 مولار )	PH
89.1	10.9	3.8
83.4	16.6	4
76.1	23.9	4.2
66.5	33.5	4.4
55.1	44.9	4.6
43.4	56.6	4.8
32.2	67.8	5
23.2	76.8	5.2
16	84	5.4
10.7	89.3	5.9

در مورد محلول بافر اسيد استيك و هيدروكسيد سديم شركت Genencor   3/6گرم در ليتر اسيد استيك 56% با 9/1 گرم در ليتر هيدروكسيد سيدم 50% را براي محدوده PH 4 تا 5/5 پيشنهاد مي كند.

نمودار 1-2 ميزان فعاليت آنزيم سلولاز اسيدي را بر حسب  تغييرات PH ‌نشان مي‌دهد همان طور كه مشاهده مي شود در محدوده 5/6-4= PHعملكرد آنزيم اپتيمم مي باشد .

اين نمودار فعاليت آنزيم را نسبت به PH هاي مختلف در درجه حرارت 60°C  نشان مي دهد. هرگونه تغييري در درجه حرارت شكل منحني را تغيير خواهد داد اين منحني ، فعاليت سلولاز را روي موادي چون CMC و كاغذ صافي مشخص ميكند و ممكن است آزمايشات به عمل آمده ، به درستي فعاليت سلولاز روي پارچه  پنبه اي نباشد.

 نكته قابل توجه اينكه PH بايد قبل از شروع فرآيند و قبل از رسيدن به درجه حرارت مورد نظر جهت عمليات تخريبي ، تنظيم و درست باشد همچنين بايد اثر PH فرآيندهاي قليايي قبلي كه برروي پارچه هاي سلولزي انجام مي گيرد تصحيح گردد .

 اثر دما در تكميل آنزيمي پنبه

 در واكنشهاي شيميايي معمولاً هر چه دما بالاتر رود سرعت واكنش بيشتر خواهد شد ولي در فرآيند بيوكاتاليكي سلولاز روي كالاي پنبه اي در دماي نسبتاً پايين فعاليت آنزيم كم است و عمليات احتياج به زمان زيادي دارد و در دماهاي بالا فعاليت آنزيم به سرعت كاهش مي يابد .

 در نمودارهاي 3-2 و 4-2 اثر درجه حرارت روي سلولازهاي اسيدي نشان داده شده است .

همانطور كه مشاهده مي شود در دماي حدود 40°C فعاليت آنزيم فقط 50% است و ماكزيمم فعاليت آنزيم در دماهاي 60 تا 65 درجه سانتيگراد ديده مي شود.

 به طور كلي در مورد سلولازهاي اسيدي ، براي انجام يك عمليات مطلوب درجه حرارت بين 55-60 درجه سانتيگراد انتخاب مي شود و حرارت پايين تر از آن باعث مي شود به زمان بيشتري احتياج باشد .

اين نمودار فعاليت آنزيم را در حرارتهاي مختلف نشان مي دهد چون در اين منحني فقط حرارت بررسي شده است PH مطلوب 5/4 ثابت بوده است و هر تغييري در PH‌ باعث تغيير شكل منحني مي شود اين نمودار نيز فعاليت آنزيم را روي موادي از قبيل CMC و كاغذ صافي نشان مي دهد و ممكن است در مورد پارچه پنبه اي صادق  نباشد.

مكانيسم فعاليت تخريبي سلولاز

سلولازها قادر به شكستن باندهاي 1-4-β گلوكزيدي و زنجير سلولزي است شكل در اين رابطه ، يك واحد سلولاز مي تواند تحت شرايط PH ‌و دماي مطلوب يك مولكول كوچك از گروه هاي احياء شونده را آزاد كند. بنابراين ميتوان سلولاز را به عنوان يك هيدرولاز – كاتاليزور تجزيه هيدروليكي ( تجزيه توسط آب ) به حساب آورد. مكان واكنش يك سلول كامل بيولوژيكي در منطقه آمورف است .

شكستن پيوندهاي سلولز به صورت آماري اتفاق نمي افتد اما مشخصاً در نقاطي كه داراي خلل وفرج بوده ( بسته به اجزاء‌تركيبي سلولاز ) به صورت تصادفي به وقوع مي پيوندد . مكانيزم اثر  آنزيمها ( به عنوان مثال كاتاليزورهاي آنزيمي ) به گونه اي است كه ابتدا يك كمپلكس مبنا ايجاد مي كند .

آنزيمها حاوي مراكز فعاليت با ساختمان سه بعدي مانند سوراخ ، حفره و .. هستند. عوامل زيادي برروي فعاليت بنيان كمپلكس آنزيمي تشكيل شده ( مثلاً كمپلكس سلولاز – سلولز ) تأثير مي گذارد كمپلكس چند تايي آنزيم سلولاز در وهله اول ( بسته به شرايط توليد ) كاملاً بي شكل است، كه همين امر سبب ويژگي تأثير پذيري آن مي باشد كمپلكس ذكر شده تحت تأثير فرآيند توليدش قرار گرفته ودر نتيجه مي تواند توسط واكنشهاي انتخابي توليد شود . نكته ديگري كه بايد به آن اشاره شود ويژگي كالاها از نظر انتخاب توسط واكنشهاي تخريبي آنزيمي ( با توجه به ساختمان بي شكل سلولز ) مي باشد و نهايتاً نوع نخ ، ساختمان مولكولي و طرح منسوج برروي تخريب سلولز تأثير مي گذارد نخهاي ظريف و يا كالاهايي كه داراي ساختمان باز مولكولي  هستند ( بويژه اليافي كه قابل دسترسي مي باشد ) مستعد تخريبي بيشتري است .

مولكول آنزيم سلولاز 100 برابربزرگتر از مولكول آب است ودر نتيجه كمپلكس تشيل شده نيز براي نفوذ به داخل ليف پنبه بزرگ مي باشد و روي سطح عمل مي كند البته ضربات مكانيكي ملايم سبب افزايش برخورد و تماس آنزيم با سطح الياف شده وتخريب درنقاط برخورد بيشتر از ساير قسمتها خواهد شد .

 واكنشهاي بيولوژيكي كمپلكس آنزيم از طريق كاهش انرژي اكتيواسيون و همچنين افزايش سرعت واكنش ايجاد مي شود كه به صورت ساده تر تحت عنوان تجزيه وفساد تدريجي بيان مي گردد و نهايتاً كمپلكس ايجاد شده سلولز را تجزيه ميكند كه اين امر با آزاد شدن محصولات جانبي واكنش مشخص مي گردد. همچنين آنزيم اوليه دوباره ايجادمي شود و مجدداً قابل استفاده است .

 فعاليت آنزيمها و بر مبناي آن اثرات تكنيكي به كارگيري آنها ، به درجه  حرارت بستگي دارد همچنين متغيرهاي موثر شيميايي (‌مانند نمكهاي آلي ، آهن ، منيزيم ،روي و غيره ) بر روي فعاليتهاي آنزيمها يا غير فعال شدن آنها و نيز تغيير ماهيت آنها اثر مي گذارد .

تغيير ماهيت آنزيمها تحت عوامل مختلفي ايجاد مي گردد كه از آن جمله انبار كردن تحت شرايط خاص و افزايش درجه حرارت مي باشد. از اثر درجه حرارت جهت توقف واكنش تخريبي در يك مرحله خاص از فرآيند در آزمايشات انجام شده استفاده شده است .